在灭菌效果验证领域，有两株标准菌株具有不可替代的核心地位：ATCC 7953（嗜热脂肪芽孢杆菌，Geobacillus stearothermophilus）和ATCC 9372（萎缩芽孢杆菌黑色变种，Bacillus atrophaeus var. niger）。它们分别是湿热灭菌和干热/EO灭菌的生物指示剂标准菌株，其D值和抗性参数被全球药典和ISO标准所引用。本文将深入解析这两株菌的特性与应用。
一、ATCC 7953 嗜热脂肪芽孢杆菌
分类学地位：嗜热脂肪芽孢杆菌原属于芽孢杆菌属（Bacillus），2001年基于16S rRNA序列分析被重新分类至嗜热脂肪芽孢杆菌属（Geobacillus），学名变更为Geobacillus stearothermophilus。但在许多药典和标准文件中，仍沿用旧称。
生物学特性：
| 特性 | 描述 |
|---|---|
| 形态 | 革兰阳性杆菌，产椭圆型中央至偏端芽孢 |
| 最适生长温度 | 55～65°C（嗜热菌） |
| 最高生长温度 | 75°C |
| 培养基 | 胰酪大豆琼脂（TSA），56±1°C培养 |
| 芽孢抗性 | 对湿热灭菌高度抗性 |
| 121°C D值 | 1.5～2.0 min（孢子悬液）；1.5～3.0 min（载体型BI） |
| z值 | 6～10°C |
应用范围：ATCC 7953是以下灭菌方式的生物指示剂标准菌株：
• 压力蒸汽灭菌（121°C / 134°C）——ISO 11138-2、GB 18278
• 过氧化氢等离子体灭菌——ISO 14937
• 过氧化氢汽雾/蒸汽灭菌（VHP）——ISO 14937
• 辐照灭菌的补充验证——ISO 11137
二、ATCC 9372 萎缩芽孢杆菌黑色变种
分类学地位：萎缩芽孢杆菌黑色变种（Bacillus atrophaeus var. niger），曾用名萎缩芽孢杆菌（Bacillus subtilis var. niger），是芽孢杆菌属中产生黑色色素孢子的变种。
生物学特性：
| 特性 | 描述 |
|---|---|
| 形态 | 革兰阳性杆菌，产椭圆型芽孢，孢子呈棕黑色 |
| 最适生长温度 | 35～37°C |
| 培养基 | 胰酪大豆琼脂（TSA），36±1°C培养 |
| 芽孢抗性 | 对干热和EO气体高度抗性 |
| 160°C干热D值 | 2.0～5.0 min |
| EO灭菌D值 | 1.5～3.5 min（在600mg/L EO浓度、50°C条件下） |
| z值（干热） | 约20°C |
应用范围：ATCC 9372是以下灭菌方式的生物指示剂标准菌株：
• 干热灭菌（160°C / 170°C / 180°C）——ISO 11138-3、GB 18280
• 环氧乙烷（EO）灭菌——ISO 11138-3、GB 18279
• 干热去热原处理（250°C / 30分钟）——USP <1228>
三、D值测定方法
D值（Decimal Reduction Value）是评价灭菌效果的核心参数。测定D值的常用方法包括：
1. 残存活菌计数法（Survival-Curve Method）
将已知数量的孢子（通常10⁶ CFU）暴露于恒定灭菌条件下，在不同时间点取样，将存活孢子接种到培养基上培养计数。绘制存活曲线（log CFU vs. 暴露时间），曲线的斜率倒数即为D值。
2. 阴性单位法（Fraction Negative Method / Stumbo-Murphy法）
将多份含已知数量孢子的BI在不同时间点取出培养，记录阳性（有生长）和阴性（无生长）的比例。通过Stumbo-Murphy统计公式计算D值。此方法是商品化BI制造商最常用的D值标定方法。
3. 预验证D值与用户验证
商品化生物指示剂（如Bionova BI和福泽爱斯BI）出厂时已标定D值和孢子数量。用户在使用前应进行验证，确认在自身灭菌设备条件下，BI的杀灭效果符合预期。验证方法通常采用半周期法：将灭菌时间设为标定杀灭时间的50%，运行后培养BI应全部阴性。
四、两种菌株的对比与应用选择
| 对比维度 | ATCC 7953 | ATCC 9372 |
|---|---|---|
| 学名 | Geobacillus stearothermophilus | Bacillus atrophaeus var. niger |
| 孢子颜色 | 白色/无色 | 棕黑色 |
| 培养温度 | 56～60°C | 36±1°C |
| 主要应用 | 湿热/过氧化氢灭菌 | 干热/EO灭菌 |
| 对湿热的抗性 | 高（D₁₂₁ ≈ 1.5-2.0 min） | 低（不适用于湿热灭菌BI） |
| 对干热的抗性 | 低 | 高（D₁₆₀ ≈ 2.0-5.0 min） |
| 对EO的抗性 | 中等 | 高 |
| 商品化BI品牌 | 3M/Bionova/福泽爱斯 | 3M/福泽爱斯 |
五、质量控制要点
使用这两株标准菌株进行灭菌监测时，需要注意以下质量控制要点：
孢子活力验证：每次使用新批号BI前，应取一片未灭菌的BI作为阳性对照，在规定的培养条件下应全部生长阳性（孢子存活）。如阳性对照出现阴性结果，说明该批BI的孢子活力不足，应予以报废。
培养温度控制：ATCC 7953的培养温度必须控制在56～60°C范围内。温度过低会导致孢子萌发缓慢、假阴性增加；温度过高（>65°C）则可能导致存活孢子也无法生长。建议使用经过校准的专用培养箱。
储存条件：商品化BI应严格按照说明书储存，通常要求15～25°C、避光、干燥。过期BI的孢子活力可能下降，导致D值降低，影响监测结果的可靠性。
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适用标准与法规
- 《中国药典》2025年版 四部通则9207 — 灭菌用生物指示剂技术要求
- GB 18281.1-2015 / ISO 11138-1:2017 — 生物指示剂 通则
- WS 310.3-2016 — 医院消毒供应中心 灭菌效果监测标准
- YY/T 1463-2016 — 医疗器械灭菌确认 生物指示剂选择与使用指南
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