作者： 杭州沐昀科技有限公司 阅读对象： 制药 / 医疗器械 QA、验证工程师、灭菌工艺开发、QC 微生物实验室、注射剂车间工艺员
干热设备往往同时承担两件事：灭菌和去热原。很多企业把两者当成“同一台隧道烘箱里温度高低不同的两个程序”，于是在去热原循环里照样放生物指示剂（BI），拿“BI 全阴性”当作去热原合格的证据——这是一个典型的验证逻辑错误。芽孢和内毒素的耐热性差着几个数量级，用错挑战物，验证就等于没做。本文把干热 BI 的选型参数、去热原为什么必须改用内毒素指示剂（EI）、以及两者抗力差异如何量化说清楚。
一、先分清两个目标：灭菌 ≠ 去热原
干热工艺有两个截然不同的工艺目标，判据、挑战物、温度区间都不一样。
| 维度 | 干热灭菌 | 干热去热原 |
|---|---|---|
| 工艺目标 | 杀灭微生物（含芽孢），达到规定无菌保证水平 | 破坏细菌内毒素（脂多糖），降低热原活性 |
| 典型温度 | 160～180 ℃ | ≥ 250 ℃（常见 250 ℃ / 300 ℃ 以上隧道烘箱） |
| 典型保温时间 | 160～170 ℃ ≥ 2 h；170～180 ℃ ≥ 1 h | 250 ℃ ≥ 45 min（隧道式按传送带停留时间折算） |
| 挑战物 | 生物指示剂 BI（萎缩芽孢杆菌芽孢） | 内毒素指示剂 EI（大肠埃希菌内毒素） |
| 合格判据 | BI 全阴性 + 阳性对照生长；FH 达标 | 内毒素下降 ≥ 3 log（1000 倍） |
| 关键标准 | ISO 20857、ISO 11138-4 / GB 18281.4 | 药典细菌内毒素检查法、USP〈1228.1〉、EU GMP 附录 1 |
核心结论： 去热原循环的温度足以在极短时间内把芽孢彻底杀灭，BI 在这里不构成任何挑战，“全阴性”是必然结果，不能证明热原被破坏。反过来，160～180 ℃ 的灭菌循环远不足以把内毒素降 3 个对数，也不能宣称“顺便去了热原”。两个目标必须各自用对应挑战物单独确认。
二、干热灭菌 BI 怎么选：菌株、载体与关键参数
干热灭菌的标准挑战菌株是萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）ATCC 9372，即旧命名体系里的“枯草芽孢杆菌黑色变种（Bacillus subtilis var. niger）”。同一菌株也用于环氧乙烷灭菌，但干热与 EO 的 D 值标称完全不同，不可混用同一批 BI 顶替（详见《环氧乙烷（EO）灭菌生物指示剂专项：选型、抗力与放行》）。
| 参数 | 干热 BI 的典型要求 | 采购与验收要点 |
|---|---|---|
| 菌株 | Bacillus atrophaeus ATCC 9372 | COA 须写明菌种学名 + 菌株编号，可溯源至标准菌种保藏机构 |
| 芽孢数 | 常见 1×10⁵～1×10⁶ CFU/片 | 以 COA 实测值代入 FH/杀灭对数计算，勿用标称区间中值 |
| D 值 | 160 ℃ 下通常 1～3 min（以 COA 标称为准） | 必须写明测定温度，“D 值 2.5 min”不注明温度无意义 |
| z 值 | 干热约 20～22 ℃ | 与湿热的 10 ℃ 差异巨大，折算 FH 时不可套用湿热 z 值 |
| 载体材质 | 不锈钢片、玻璃、石英砂 | 不可用纸片载体——180 ℃ 以上纸质碳化，载体本身被破坏 |
| 形态 | 载体型（芽孢条/片） | 自含式 BI 不适用于干热，塑料管与培养基在高温下熔化失效 |
| 包装 | 耐高温材质，或去外包装裸放于工装 | 常规透气纸塑袋在干热下同样碳化，需确认耐温 |
这两条“不可用”是干热场景最常见的选型翻车点：纸片载体和自含式 BI 是湿热/EO 的主流形态，直接搬到干热箱里会烧坏。BI 形态之间的适用边界见《载体型、自含式、快速型怎么选？生物指示剂形态对比》。
培养条件：萎缩芽孢杆菌用胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）等推荐培养基，30～35 ℃ 培养，常规判读 7 天（与嗜热脂肪地芽孢杆菌的 55～60 ℃ 完全不同，培养箱设错温度会直接造成假阴性）。
三、去热原为什么必须改用内毒素指示剂（EI）
内毒素是革兰阴性菌细胞壁的脂多糖（LPS），本质是化学分子而非活体，其“灭活”是热破坏而非杀菌。LPS 的干热耐受性远高于芽孢：
- 芽孢在 250 ℃ 下的存活时间以秒计，D 值小到无法测量；
- 而把内毒素活性降低 3 个对数，250 ℃ 下仍需几十分钟量级的暴露。
所以去热原确认使用内毒素指示剂（Endotoxin Indicator，EI）——把已定量的大肠埃希菌内毒素（通常 ≥ 1000 EU/支，即足以支撑 3 log 下降的检出余量）涂布在安瓶、西林瓶或不锈钢载体上，随物料过一遍最差条件循环，回收后用细菌内毒素检查法（凝胶法/光度法/重组 C 因子法）测残留活性。
判据： 内毒素回收活性相比初始加载量下降 ≥ 3 log（≥ 99.9%），且必须同时做回收率对照——未经热处理的同批 EI 需能定量回收出接近标称的内毒素量，否则“测不到”可能只是回收方法失效，而不是热原被破坏。这与 BI 试验必须带阳性对照的逻辑完全一致（参见《生物指示剂使用全流程：放置、培养、判读与对照》）。
四、抗力差异怎么量化：FH 与两套动力学
干热灭菌的热效应折算用 FH 值，与湿热的 F₀ 同构，但参比温度与 z 值不同：
- F₀：参比温度 121.1 ℃，z = 10 ℃（湿热）
- FH：参比温度 160 ℃，z = 20 ℃（干热）
杀灭对数数 = FH / D160。举例：某循环实测 FH = 30 min，BI 标称 D160 = 2.0 min，则该点位获得 15 个对数的杀灭能力；若初始芽孢数为 1×10⁶（6 log），理论残存概率已远低于 10⁻⁶，满足无菌保证水平要求。D 值、z 值与芽孢数如何组合成可计算的杀灭挑战，见《一文读懂 D 值、Z 值与芽孢数：生物指示剂三大核心参数》与《生物指示剂与无菌保证水平（SAL）：10⁻⁶ 是怎么算出来的》。
关键提醒： z 值套错是干热验证的高频错误。用湿热 z = 10 ℃ 去折算 170 ℃ 的干热循环，会把等效暴露时间算得离谱地大，得出“远超要求”的假安全结论。干热必须用干热 z 值，且以所用 BI 的 COA 实测 z 值优先。
内毒素灭活则不套用微生物 D/z 体系。虽然文献上也用“内毒素 D 值”描述其一阶衰减，但 LPS 热解动力学非严格对数线性，且不同来源 LPS 差异明显，所以法规不要求把内毒素折算成 FH，而是直接以实测 3 log 下降作为终点判据。这也是为什么去热原不能靠“温度-时间达标”推定合格，必须做 EI 实测挑战。
五、验证怎么做：干热箱与隧道烘箱的布点差异
干热工艺的 IQ/OQ/PQ 框架与其他灭菌方式一致（参见《灭菌验证怎么做？生物指示剂在 IQ/OQ/PQ 中的角色与 PCD 选择》），但布点上有两个特殊点：
间歇式干热箱（烘箱）
- 空载热分布：确认腔体温度均匀性，识别冷点；
- 装载热穿透：探头插入代表性物料内部，找最差条件位置；
- BI/EI 放置：优先放冷点、装载中心、门侧与角落；每个位置探头与挑战物成对放置，才能把 FH 与生物/内毒素结果对应上。
连续式隧道烘箱
- 挑战的是传送带速度 × 高温段长度决定的停留时间，而不是“设定温度”；
- EI 需随瓶子在带上实际走一遍，按带宽方向多点布放（两侧边缘常是冷点）；
- 需确认最快带速 + 最大装载密度的最差条件；
- 层流保护与压差同样属于确认范围（去热原隧道出口通常进 A 级区）。
共同要求： 挑战物必须在最差条件下考核，且日常监控点位与验证冷点一致。BI/EI 出现意外阳性或内毒素下降不足 3 log 时，按偏差流程调查，处理逻辑参照《阳性结果怎么办？生物指示剂阳性调查与偏差处理》。
六、常见误区与放行检查清单
| 误区 | 为什么错 | 正确做法 |
|---|---|---|
| 去热原循环里放 BI 当合格证据 | 250 ℃ 下芽孢秒级死亡，BI 无挑战性，全阴性是必然 | 去热原用 EI，判据为内毒素 ≥ 3 log 下降 |
| 灭菌循环宣称“顺便去热原” | 160～180 ℃ 不足以把内毒素降 3 log | 两个目标分别用对应挑战物单独确认 |
| 用湿热 z = 10 ℃ 折算干热 FH | 干热 z 约 20～22 ℃，套错会高估等效暴露时间 | 用干热 z 值，优先取 COA 实测值 |
| 用纸片载体或自含式 BI 进干热箱 | 纸质碳化、塑料管熔化，载体先失效 | 选不锈钢/玻璃/石英砂载体的载体型 BI |
| 萎缩芽孢杆菌按 55～60 ℃ 培养 | 培养温度错误导致不生长 | 30～35 ℃ 培养，7 天判读 |
| EI 只测热处理后样品 | 无回收率对照，“测不到”可能是方法失效 | 同批未处理 EI 做回收对照，确认可定量回收 |
| D 值不注明测定温度 | “D = 2.5 min”无温度即无意义 | COA 须写明 D160 或对应测定温度 |
放行前自查（干热灭菌）
- BI 菌株为 B. atrophaeus ATCC 9372，COA 齐全且在效期内；
- 芽孢数、D 值（注明温度）、z 值取自 COA 实测；
- 载体耐温、形态适用于干热；
- 各点位 FH 达标，杀灭对数数满足 SAL 要求；
- BI 全阴性，阳性对照正常生长，培养温度 30～35 ℃ 记录完整。
放行前自查（去热原）
- EI 内毒素加载量足以支撑 3 log 下降的检出余量；
- 未处理同批 EI 回收率对照合格；
- 最差条件（最快带速 / 最大装载）已覆盖；
- 处理后内毒素残留活性下降 ≥ 3 log；
- 温度记录与停留时间符合确认参数。
选型层面的整体对照（蒸汽 / EO / 干热 / VHP 各用什么菌株、什么形态），可回看《你的灭菌方式该用哪种生物指示剂？（蒸汽 / EO / 干热 / VHP 选型指南）》。
法规依据说明：本文涉及的技术要求主要参照 ISO 20857（干热灭菌工艺开发、确认与常规控制）、ISO 11138-1 / ISO 11138-4 及对应国标 GB 18281.1 / GB 18281.4（干热灭菌用生物指示物）、《中华人民共和国药典》通则灭菌法与细菌内毒素检查法、USP〈1228〉/〈1228.1〉（去热原与干热去热原）以及 EU GMP 附录 1 关于去热原 ≥3 log 内毒素下降的要求。具体版本号与条款请以现行有效版本为准，并结合本企业注册要求与质量体系文件执行。
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