作者：杭州沐昀科技有限公司 阅读对象：制药 / 医疗器械企业无菌工艺与验证工程师、质量保证（QA）与质量控制（QC）微生物人员、灭菌工艺负责人、培养基模拟灌装（APS / Media Fill）的组织与判读人员
培养基模拟灌装做完了，报告上却写着"本次 APS 同步放置生物指示剂 12 支，全部阴性"——这句话在审计现场往往会被追问第三个问题：这 12 支到底证明了什么？培养基模拟灌装判读的是"工艺在模拟条件下能不能保持无菌"，生物指示剂判读的是"某个灭菌或去污染过程有没有达到既定抗力挑战"。两者对象不同、判据不同、失败后的调查路径也不同。本文把 APS 与 BI 的接口拆开讲：哪些环节该放 BI、布点数量凭什么定、培养基与培养条件怎么判读、APS 阳性与 BI 阳性为什么会分叉成两条调查链，以及如何把两套记录串成一条审计能一次讲通的主线。
一、先划边界：APS 判读的是"工艺"，BI 判读的是"抗力"
讨论"APS 里要不要放 BI"之前，必须先把两类工具的判读对象分开。混淆这两者，是 APS 方案里最常见的设计缺陷，也是审计员最容易抓住的软肋。
培养基模拟灌装（APS，也称 Media Fill）的本质，是用培养基替代产品、用真实的操作序列替代生产过程，去回答"在最长允许的暴露时间与最密集的干预条件下，这套人—机—料—法—环的组合能不能持续产出无菌单位"。它的判读单位是灌装单位（瓶、支、袋），判读信号是培养基是否浑浊，失败的语义是"工艺过程引入了微生物污染"。
而生物指示剂的本质，是用已知抗力与已知芽孢数的标准微生物挑战，去回答"某一个灭菌或去污染过程，是否达到了足以覆盖目标微生物的杀灭强度"。它的判读单位是指示剂本身，判读信号是培养后是否生长，失败的语义是"这个过程没有达到既定的抗力挑战要求"。关于三大核心参数（D 值、Z 值、芽孢数）的含义，可参见一文读懂 D 值、Z 值与芽孢数。
| 对比维度 | 培养基模拟灌装（APS） | 生物指示剂（BI） |
|---|---|---|
| 回答的问题 | 工艺过程能否持续保持无菌 | 某个灭菌 / 去污染过程是否达到既定杀灭强度 |
| 挑战物 | 模拟操作本身，无人工接种 | 已知菌株、已知芽孢数、已知 D 值 |
| 判读单位 | 灌装单位（瓶 / 支 / 袋） | 指示剂（载体 / 安瓿 / 自含式） |
| 判读信号 | 培养基浑浊（需排除假阳性） | 培养后生长 / 荧光 / 酶反应 |
| 合格判据 | 污染单位数在既定限度内（通常为 0） | 挑战后无生长，且阳性对照生长、阴性对照不生长 |
| 失败语义 | 过程引入了污染 | 过程未达到抗力要求 |
| 调查方向 | 人员操作、干预、环境、器具、 glove 完整性 | 灭菌参数、装载、BI 自身、培养条件、判读 |
这张表说明了一件事：APS 的"灌装单位"本身不需要、也不应该放 BI——在灌装瓶里塞一支生物指示剂，既改变流体状态，又引入额外的微生物，反而污染了模拟的真实性。BI 在 APS 中的合理位置是"前段与外围"：进入无菌核心区之前必须被灭菌或去污染的部件、器具、管路、过滤器与设备内表面。这正是生物指示剂在无菌工艺模拟（APS）中的应用一文给出的定位，本文在其基础上展开工程细节。
二、APS 前段的 BI 布点：部件、器具与无菌组装
APS 开始之前，所有要进入 A 级区、或要与产品接触的物件，都需要先完成灭菌或去污染。这一段的 BI 布点，是 APS 体系中 BI 用量最大、也最容易被"凭经验放置"的地方。
建议按"物件—灭菌方式—最难位置—BI 形态"四要素逐项建表，而不是到现场临时决定。典型对象如下：
| 需确认对象 | 典型灭菌 / 去污染方式 | 最难位置（布点优先） | 推荐 BI 形态 |
|---|---|---|---|
| 灌装针、分装管路、蠕动泵管 | 湿热灭菌（121 ℃）或在线 SIP | 管路最远端、最低点、弯头内侧、快接盲端 | 载体型条带 / 自含式（可置入管腔） |
| 储液袋、过滤器外壳 | 湿热灭菌或辐照 | 过滤器下游侧、壳体螺纹与密封圈凹槽 | 载体型 + 外部对照 |
| 除菌级滤芯 | 出厂灭菌 + 使用前完整性测试 | 不布 BI，以完整性测试 + 截留试验为准 | 不适用（以物理方法为主） |
| 胶塞、铝盖 | 湿热灭菌或辐照后转入 | 料斗中心、堆叠最密处 | 载体型（耐热，随物料同位置） |
| 工装、镊子、容器 | 双扉灭菌柜 / VHP 传递 | 器械咬合面、盲孔、叠放内层 | 载体型或自含式 |
| 无菌服、手套 | 湿热灭菌或辐照 | 袖口折叠处、手套指缝 | 载体型（避免压迫芽孢载体） |
三个布点原则值得写进 SOP：
- 放在最难点，而不是最顺手的地方。BI 的价值在于挑战最不利位置。放在门口、表层、易取处，等于把挑战强度降了一个等级。最难灭菌点的识别方法参见灭菌验证中 BI 的角色与 PCD 选择。
- 布点要与真实物件"同位置、同装载、同循环"。单独放一支 BI 在空腔里跑一个循环，不能代表满载状态的传热与穿透。BI 必须与真实物件一起经历同一个灭菌 / 去污染循环，否则结论不可外推。
- 每支 BI 都要有唯一编号与位置图。APS 报告里应附布点示意图，图上编号与记录表编号一一对应。没有位置图的布点，在审计中等同于没有布点。
三、隔离器 / RABS 去污染后的 BI 布点与时序安排
在隔离器与 RABS 场景下，APS 前还有一道关键工序——内表面的过氧化氢（VHP）去污染。这一段的 BI 布点与湿热灭菌的差别在于：气态灭菌的均匀性依赖气流与空间几何，不像蒸汽那样靠冷凝传热。
布点建议遵循"三层覆盖"：空间代表点（腔体几何中心与上、中、下三个高度）、几何死角（角落、门封、传递舱接口、HEPA 送风口背面、手套内壁）、负载界面（物料表面、器械咬合面、包材内表面）。每个点位建议至少重复三次循环以观察重现性，首次确认时可加密点位。
时序上有一个常被忽略的细节：BI 挑战应在去污染循环结束后、APS 正式开始前完成回收，且不能让 BI 的回收动作本身破坏已建立的洁净状态。常见做法是：去污染循环 → 取出 BI 并立即培养或置于规定条件 → 通风与残留确认 → APS 开始。若 BI 结果未出就先跑 APS，需要在 APS 方案中明确"BI 结果为阳性时本次 APS 的有效性如何判定"，否则一旦 BI 阳性，整场 APS 的合格性就会陷入争议。VHP 抗力与空间杀灭确认的细节参见过氧化氢（VHP）生物指示剂深度专项，隔离器场景的整体设计参见隔离器与 RABS 中的生物指示剂。
四、布点数量的工程依据：覆盖最难位置，而不是越多越好
"放几支"是最常被问、也最少被论证的问题。答案既不是"按经验放 10 支"，也不是"能放多少放多少"，而应由三个变量共同决定：待确认对象的空间复杂度、历史数据的重现性、以及本次 APS 的风险等级。
| 影响因素 | 判据 | 常见做法 |
|---|---|---|
| 空间复杂度 | 腔体体积、几何死角数量、负载密度 | 每个识别出的最难点至少 1 支，死角 ≥ 3 个时每个死角布点 |
| 过程重现性 | 历史同点位结果的标准差与温度 / 浓度分布 | 重现性差则加密点位并重复 3 次循环 |
| 风险等级 | 是否为首次确认、是否涉及变更、是否为新产品 / 新装载 | 首次或变更后加密；周期性回顾可维持基线数量 |
| 统计期望 | 期望检出的差异幅度与可接受误判风险 | 以"能区分最难点与非最难点"为目标，而非追求统计显著性 |
| 成本与可操作性 | 回收难度、对洁净状态的干扰 | 在不影响 APS 真实性的前提下取上限 |
需要提醒的是：布点数量增加会同时放大两类风险——一是回收与判读工作量上升带来的记录差错，二是点位过密时操作人员进出 A 级区的干预次数增加，反而提高了 APS 自身的污染风险。因此布点方案应在"最难点覆盖度"与"干预次数最小化"之间取平衡，并把平衡的理由写进方案。相关风险排序方法可参考用 FMEA 把 BI 的失败模式纳入无菌保证体系。
五、培养基、培养条件与判读：双温培养、GPT 与判读时间点
APS 与 BI 在"培养"这一步上最容易串线，因为两者都要进培养箱，但培养对象、温度与时间并不相同，混放混判是典型的体系缺陷。
| 对象 | 培养基 / 介质 | 培养温度 | 培养时间 | 判读方式与注意点 |
|---|---|---|---|---|
| APS 灌装单位 | 大豆酪蛋白消化物（SCD / TSB）等广谱培养基 | 先低温后高温的双段培养（典型为 20–25 ℃ 后 30–35 ℃，或按企业既定方案） | 总时长通常不少于 14 天 | 目测浑浊；浑浊需转种鉴定，排除培养基自身与操作污染 |
| BI（常规培养型） | 指示剂自带培养基（自含式）或专用复苏培养基 | 按菌株最适生长温度（典型 55–60 ℃ 用于嗜热脂肪地芽孢杆菌，30–35 ℃ 用于萎缩芽孢杆菌等） | 按说明书，通常 24–48 小时至 7 天 | 生长 / 变色 / 荧光判读；必须同步阳性对照与阴性对照 |
| BI（快速型） | 荧光或酶反应体系 | 按说明书恒温 | 通常 1–4 小时 | 仪器判读；需保留与常规法的可比性确认数据 |
| 生长促进试验（GPT） | 与实际使用相同的培养基 / 复苏介质 | 同使用条件 | 按药典 / 方案规定 | 接种低量标准菌株须能生长，证明介质支持生长能力 |
四个判读细节必须落到 SOP 与记录表：
- APS 单位与 BI 不得共用同一培养箱而混放。温度要求不同，混放会同时损害两边的判读可靠性。确需共用设备时，应分区、分时并有明确标识与温度分布验证支持。
- 培养箱本身要有温度分布验证与报警响应。培养箱验证、判读时间与 GPT 的系统要求详见培养基与培养判读：培养箱验证、判读时间与生长促进试验。
- 每一次判读都要做 GPT。培养基或复苏介质的支持生长能力未被确认，阴性结果就不成立——这是"假阴性"的主要来源之一，排查思路参见假阳性与假阴性：误判原因与排查清单。
- 判读时间点要预先定义，不允许"看到结果再决定什么时候判读"。快速 BI 的判读窗口尤其要严格，超窗判读的结果应判为无效并重做。
六、结果解释：APS 阳性与 BI 阳性是两条不同的调查路径
同样的"长出东西"，APS 阳性与 BI 阳性指向完全不同的根因域。把两者混为一谈，会导致调查方向跑偏、CAPA 无效。
| 环节 | APS 阳性（灌装单位浑浊） | BI 阳性（指示剂生长） |
|---|---|---|
| 直接结论 | 本次模拟的工艺过程引入了污染 | 该灭菌 / 去污染过程未达到抗力要求（或判读被干扰） |
| 首要排查域 | 人员干预、手套 / 袖口完整性、环境监控数据、器具与物料、操作序列 | 灭菌参数与分布、装载方式、BI 自身抗力与效期、培养条件、对照结果 |
| 关键对照 | 环境监控（沉降 / 浮游 / 表面）与阴性对照单位 | 阳性对照（应生长）与阴性对照（不应生长） |
| 与本文系列的接口 | BI 与 EM 协同、CCS | 阳性调查与偏差处理、假阳性与假阴性 |
| 对本次 APS 有效性的影响 | 通常直接判定本次 APS 失败或需按方案分级评估 | 视点位而定：前段部件 BI 阳性意味着该部件的无菌性证据缺失，需评估 APS 是否仍能成立 |
| 常见 CAPA | 干预优化、再培训与资质确认、手套管理制度、环境整改 | 装载与参数优化、最难点重新识别、BI 验收与储存整改、对照流程重建 |
有一条判定规则值得写进方案：BI 阳性时，先不要急着宣布 APS 失败，先确认这个点位是否属于"APS 有效性的前置条件"。如果该 BI 用于确认灌装针组件的灭菌，那么它的阳性意味着"进入无菌核心区的部件无菌性未被证明"，本次 APS 的证据链从根上就不完整；如果该 BI 只是用于确认外围某一非产品接触面，则可以走偏差评估，论证其对本次 APS 无实质影响后保留 APS 结论。无论哪种，都必须在 APS 报告中留下完整的评估记录，而不是口头解释。
BI 自身的验收、储存与效期问题常常是"被误判为工艺失败"的元凶，排查时请优先检查生物指示剂储存、效期与验收管理中列出的字段，以及BI 使用全流程中的对照设置。
七、把 APS 与 BI 的记录链起来：审计能在三步内讲通
审计员在 APS 主题上最常问的三个问题，本质上都在检验"两套记录能不能互相索引"：这次 APS 用了哪些 BI？这些 BI 的抗力数据从哪来？如果其中有阳性，你们的判定依据是什么？
建议的最小记录链如下：
- 布点清单：编号、位置描述、所属物件、灭菌 / 去污染循环编号、BI 批号、效期、标称芽孢数与 D 值来源（COA）。
- 过程记录：循环开始与结束时间、关键参数（温度 / 压力 / 浓度 / 时间）、BI 回收时间与回收人、偏离情况。
- 判读记录：培养起止时间、培养箱编号与温度、判读时间点、判读人、阴性 / 阳性对照结果、结论。
- 关联记录：本次 APS 编号与批次、布点示意图、阳性时的偏差调查编号、CAPA 编号。
这四组字段统一在一张表或一组互相索引的表里，审计追问就能在三步之内走到原始记录。文件骨架与模板化写法参见生物指示剂 SOP 与记录体系（模板化写法），人员资质与授权要求参见生物指示剂人员培训与资质确认。
八、八个常见误区与 APS 负责人落地清单
把 APS 与 BI 的接口做对的标志，不是"BI 全阴"，而是"每一支 BI 的存在理由、位置、结论都能被一句话说清"。下面是现场最高频的八个误区。
| 误区 | 问题实质 | 纠正方向 |
|---|---|---|
| 在灌装瓶里放 BI 一起培养 | 改变了模拟流体状态并额外接种，破坏 APS 真实性 | BI 只用于前段与外围，APS 单位靠培养基判读 |
| 布点凭经验、无固定位置图 | 结果不可重现，审计无法追溯 | 建立标准布点图并纳入方案，编号与记录一一对应 |
| 只放在顺手处、不放最难点 | 挑战强度被系统性降低 | 以最难点识别结果驱动布点 |
| BI 单独跑空循环 | 不代表满载状态的传热与穿透 | BI 与真实物件同装载、同循环 |
| APS 单位与 BI 混放同一培养箱 | 温度条件互相损害 | 分区分时，并有温度分布验证支持 |
| 不做生长促进试验就判阴性 | 阴性结果可能只是介质不支持生长 | 每次判读同步 GPT，GPT 失败则该批判读无效 |
| BI 阳性直接判 APS 失败（或不判失败） | 缺少"是否属于前置条件"的评估逻辑 | 方案中预定义点位分级与判定规则，结论留痕 |
| 只记结论不记过程 | 无法排除假阳性 / 假阴性 | 记录培养时间、温度、对照结果、判读人 |
给 APS 负责人的落地清单，建议按半年一次的频率自查：
- 布点图是否为最新版，是否覆盖了经确认的最难点；
- 每一支 BI 的批号、效期、COA 是否可在三步内调出；
- 培养箱温度分布验证与 GPT 是否在有效期内；
- 阳性判定规则是否已写入方案并经质量部门批准；
- 上一次 APS 的偏差与 CAPA 是否已闭环并有有效性检查；
- 参与判读的人员是否在授权清单内。
把这些问题常态化，APS 与 BI 就不再各自为政：APS 回答"工艺能不能守住无菌"，BI 回答"支撑这个工艺的灭菌与去污染过程够不够硬"，两条证据链互相咬合，无菌保证的结论才站得住。
法规依据说明：本文涉及的通用要求参考中国 GMP（2010 年修订）附录 1 无菌药品、中国药典 2025 年版通则（灭菌法、生物指示剂与微生物限度相关通则）、ISO 11138 系列（生物指示剂通则与各类灭菌用指示剂）、ISO 14161（生物指示剂应用指南）、ISO 17665（湿热灭菌）、ISO 13408 系列（无菌加工）、EU GMP Annex 1（2022 年版无菌药品生产）、FDA 无菌工艺无菌药品 cGMP 指南（2004）、21 CFR 211、ICH Q10 药品质量体系、ICH Q9（R1）质量风险管理、PDA TR-1 湿热灭菌验证与 PDA TR-22 无菌灌装工艺模拟、ISO 14644 系列洁净室相关标准。具体执行应以现行版本法规、产品注册资料与企业内部质量文件为准。
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