上一篇文章讲菌株保藏与传代管理时提到：自制芽孢悬液的制备、定量计数与活力回收率标定，是一条独立的技术线，值得单独成文。本文补上这一环。芽孢悬液是生物指示剂研发、消毒剂效力评价与灭菌验证试验的起点物料，它的质量直接决定后续所有数据的可信度：活菌数标不准，杀灭对数值就算不对；芽孢纯度不够，试验结果就分不清是消毒剂的作用还是杂菌的干扰。
核心结论：一支合格的芽孢悬液要过三道量化关口。一是纯度关口，镜检芽孢形成率达到 95% 以上方可收集；二是安全关口，经 80℃ 水浴 10 分钟（或 60℃ 30 分钟）处理杀灭残余繁殖体；三是定量关口，使用前实测活菌数，且生物指示物的实测活菌数应落在标定值的 50%~300% 区间（GB/T 18281.1 规定）。三个数字都有标准出处，缺一不可。
一、为什么悬液质量决定整个验证的成色
消毒剂杀菌效力评价、灭菌器生物验证、抗力测定仪的 D 值标定，共同依赖同一种物料：高纯度、高浓度、活菌数明确的芽孢悬液。以悬液定量杀菌试验为例，试验要计算杀灭对数值，公式是阳性对照组活菌数的对数减去试验组回收菌数的对数。阳性对照数本身就是悬液的实测活菌数，这个起点错了，后面所有的差值都失去意义。
《消毒技术规范》（2002 年版）与卫生行业标准 WS/T 683-2020《消毒试验用微生物要求》对试验用芽孢悬液的制备给出了可执行的程序；GB/T 18281.1《医疗保健产品灭菌 生物指示物 第 1 部分：通则》则从生物指示物的角度规定了活菌数与抗力的合格判定。两条线的技术要点高度一致，可以互相印证。本文以这两条标准线为骨架展开。
二、制备全流程：从菌种到悬液的九个步骤
以下流程综合《消毒技术规范》（2002 年版）试验用菌悬液制备程序与 WS/T 683-2020，以枯草杆菌黑色变种 ATCC 9372 为例（湿热灭菌相关试验常用嗜热脂肪地芽孢杆菌，流程一致，培养条件按菌株调整）。
第 1 步 · 菌种准备与代次控制
开启冻干菌种后连续传代培养，制备芽孢悬液使用第 3 代至第 5 代的 18~24 小时营养肉汤培养物。代次过高的培养物产孢能力与抗力稳定性下降，这是标准把接种物限定在 3~5 代的用意。代次管理规则见本站菌株管理专文。
第 2 步 · 产孢培养
吸取 5.0~10.0 ml 培养物接种于罗氏瓶（或克氏瓶）营养琼脂培养基表面，摇动使菌液铺满斜面后吸去多余液体，置 37℃ 培养箱培养 5~7 天。产孢培养基的表面积要足够大，培养基表面干燥程度影响芽孢形成，这是操作中的经验要点。
第 3 步 · 芽孢形成率镜检
取菌苔涂片，按改良芽孢染色法处理：涂片干燥固定后，覆两层滤纸滴足量 5% 孔雀绿水溶液，54~56℃ 加热 30 分钟，水洗后再以 0.5% 沙黄水溶液复染 1 分钟。油镜下芽孢呈绿色、菌体呈红色。当芽孢形成率达到 95% 以上时即可进入收集环节；未达标则继续室温放置，直至形成率合格。此步不合格就往下走，收集到的"悬液"里繁殖体占比过高，后续热处理也补不回来。
第 4 步 · 洗脱与分散
每瓶加 10.0 ml 无菌蒸馏水，用 L 形棒轻刮菌苔洗下，再补 5.0 ml 冲洗培养基表面一遍。两批洗脱液集中至含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇 5 分钟打碎菌块，使成均匀悬液。
第 5 步 · 自溶断链
必要时将悬液置 45℃ 水浴 24 小时，使残余菌体自溶、断链，芽孢分散成单个状态。芽孢团聚是计数偏差的主要来源之一，此步是为均匀性服务。
第 6 步 · 过滤除杂
用无菌棉花或纱布过滤悬液，清除琼脂凝块与菌苔碎片。凝块残留会堵塞吸头、干扰移液精度，还会在平皿上形成假性菌落团。
第 7 步 · 离心清洗
悬液转入无菌离心管，3000 r/min 离心 30 分钟，弃上清，加无菌蒸馏水吹吸重悬，如此反复清洗共 3 遍。清洗的目的在于去除培养基残留、代谢产物与可溶性杂质：残留过多可能影响消毒剂效力判断，芽孢团聚则直接造成计数失真。
第 8 步 · 热处理杀灭残余繁殖体
洗净的芽孢液置 80℃ 水浴 10 分钟（或 60℃ 30 分钟），杀灭残余的细菌繁殖体，冷却至室温后保存。注意：此步的对象是残余营养细胞，不是芽孢本身；处理目的是提高纯度，条件过强反而诱发芽孢损伤与计数偏低。
第 9 步 · 分装保存与效期
充分摇匀分装，置 4℃ 冰箱避光保存，标准给出的有效使用期为 6 个月。保存期间避免反复冻融、频繁温度波动与长时间室温放置；每次取用前先做活菌培养计数，不能凭制备时的浓度推算长期保存后的使用浓度。
三、两个容易混淆的热处理：杀灭繁殖体与热激活
芽孢试验里出现"加热"字样的场合不止一处，初学者极易把两种目的不同的热处理混为一谈。
第一类是制备阶段的热处理，即上文第 8 步：80℃ 10 分钟或 60℃ 30 分钟，目标是杀掉悬液里残余的繁殖体，属于纯化工序。芽孢在此温度下短时间处理是安全的，这恰恰利用了芽孢与营养细胞之间的耐热落差。
第二类是计数前的热激活（heat activation），目的相反：适度加热打破芽孢休眠、促进萌发，让计数结果反映真实的活芽孢数量。国内外生物指示剂制造商的技术资料普遍要求芽孢计数前进行热激活处理，例如针对嗜热脂肪地芽孢杆菌类湿热灭菌生物指示物，常用 95~100℃ 水浴 15 分钟（厂商技术资料口径，具体条件以所用产品的制造商方法为准）。热激活温度过高或时间过长会引发芽孢提前灭活，造成计数偏低，这是被反复验证过的失效模式。
两者的区分要点记一句话：制备时的加热是为了"只留芽孢"，计数前的加热是为了"让芽孢都长出来"。ISO 11138-7 明确要求，验证生物指示剂含菌量时应遵循制造商提供的方法与材料，因为稀释液、热激活条件等细节差异可能对结果产生重大影响。
四、定量计数操作要点
计数按《中国药典》2025 年版四部通则 1105（微生物计数法）的平皿法执行：悬液经系列 10 倍稀释后，取适量接种于营养琼脂培养基，倾注或涂布，培养后点计菌落形成单位（CFU）。操作中有五个要点直接决定数据质量。
1. 稀释液的选择。不同稀释液对芽孢计数结果有实际影响：有生物指示剂制造商的比对数据显示，使用 0.1% 蛋白胨水溶液或含吐温 80 的盐水溶液作为稀释液时，芽孢计数结果偏低；其建议按药典要求选用无菌水作为稀释液。无论最终采用哪种，都应固定写入程序并在验证数据中说明依据。
2. 悬液充分打散。计数前必须振摇使芽孢均匀分散；含纸质载体的生物指示物取样时，建议用直径 4~6 mm 的玻璃珠振摇打散，让载体上的芽孢充分释放到液体中。洗脱不充分是计数偏低的高频原因。
3. 移液防纤维干扰。纸质载体浸泡液吸取时注意避免纤维堵塞枪头，导致移液体积失准。有条件的实验室可对每片（支）生物指示物单独计数，以每份的活菌数均满足要求为验收目标。
4. 热激活条件与菌株匹配。嗜热菌株与常温菌株的热激活条件不同，执行前核对所用标准或制造商方法，不得把一种菌株的条件套用到另一种上。
5. 平皿菌落数处于可统计区间。稀释度设计应使培养后的平皿菌落数落在可准确点计的范围（通常以每皿 30~300 CFU 为宜，按药典通则执行），两个稀释度平行操作并取平均值。
五、活力回收率与合格判定依据
"活力回收率"在实务中有两层含义，判定标准各不相同。
第一层：活菌数对标定值的回收。GB/T 18281.1 规定，在生物指示物有效期内，制造商或第三方机构利用制造商给出的方法检测出的活菌数量，应介于制造商标定值的 50%~300% 之间。这是国际通行口径（等同采用 ISO 11138-1），现行版本 GB/T 18281.1-2024 已于 2025 年 12 月 1 日起实施，代替 GB 18281.1-2015。举例：某自含式生物指示剂标定含菌量为 1.0×10⁶ CFU/支，则实测活菌数在 5.0×10⁵ 至 3.0×10⁶ 之间为合格；低于下限意味着挑战强度不足，高于上限则可能影响灭菌时间裕度的评估。
第二层：载体洗脱回收率。染菌载体（菌片）形式的试验中，芽孢从载体表面洗脱下来的比例决定计数的代表性。洗脱回收率受载体材质、洗脱液组成、振摇方式影响，各标准与验证方案对此的具体限值要求不一，执行时以所用标准的相应条款或经验证的方案为准，不套用悬液法的口径。
与活菌数并行的是抗力指标的复测：GB/T 18281.1 要求，在有效期内用制造商方法复测标定的 D 值，结果应在标定值的 ±20% 范围之内；D 值测定应采用存活曲线法与部分阴性分析法等方法的组合，存活曲线应保持线性关系。若残存曲线数据点离散严重、线性不佳，提示存在亚致死损伤菌群的干扰或操作误差，应排查后再下结论。
六、常见计数偏差来源与对策
| 偏差来源 | 典型表现 | 对策 |
|---|---|---|
| 芽孢团聚 | 同一平皿菌落分布极不均匀，稀释度间数据不成比例 | 振摇打散、玻璃珠处理、必要时重复自溶断链 |
| 洗脱不充分 | 载体法实测活菌数系统性偏低 | 延长振摇时间、使用玻璃珠释放、逐片验证洗脱效率 |
| 稀释液不当 | 改换稀释液后计数结果明显变化 | 固定稀释液种类，优先无菌水或按制造商方法执行 |
| 热激活过度 | 计数偏低且随加热时间延长而加重 | 核对温度与时间的匹配条件，水浴温度经校准 |
| 移液体积失准 | 平行皿差异大、稀释度间不成梯度 | 防纤维堵头，移液器定期校准，悬液吹吸混匀后取样 |
| 保存期活性衰减 | 存放数月后使用时实测值明显低于制备时 | 遵守 6 个月效期，每次取用前重新计数 |
常见问题
芽孢形成率不到 95% 怎么办？
继续室温放置培养物，促使未形成芽孢的菌体完成产孢，期间隔日重新涂片镜检；仍不达标的批次应弃去并从菌种、培养基与培养条件三方面排查，常见原因包括接种物代次过高、培养基表面过湿、培养温度偏离。
80℃ 加热 10 分钟会不会把芽孢杀死？
不会。该条件是《消毒技术规范》给出的标准纯化工序，利用的是繁殖体与芽孢之间的耐热落差：残余营养细胞被杀灭，芽孢在短时间处理下存活。但要防止条件失控，温度过高或时间过长会诱发芽孢亚致死损伤，表现为后续计数偏低。
生物指示剂的活菌数实测值超出 50%~300% 区间怎么处理？
低于下限的批次不应继续作为挑战物料使用：挑战强度不足会使灭菌验证的结论失去说服力。高于上限的批次需重新评估其对灭菌时间裕度的影响。两个方向都应先复核计数方法本身（洗脱、热激活、稀释液）是否按制造商方法执行，排除方法偏差后再对批次下结论。
自制芽孢悬液与商品化芽孢悬液怎么选？
自制悬液适合消毒剂效力评价等按《消毒技术规范》执行的试验场景，优势是浓度可调、成本低，代价是每一批都要走完制备与标定的全流程。商品化悬液与生物指示物随批附带标定数据，直接用于灭菌验证与抗力测定更省事。选用商品化产品时核对批次 COA 上的活菌数、D 值与效期，验收时的计数复核规则见本站菌株管理专文。
参考资料
1. 《消毒技术规范》（2002 年版），卫生部：试验用微生物菌悬液与芽孢悬液制备程序（无菌蒸馏水洗脱、玻璃珠分散、45℃ 自溶、3000 r/min 离心清洗、80℃ 10 min 或 60℃ 30 min 热处理、4℃ 保存有效期半年、芽孢形成率 95% 要求）
2. WS/T 683-2020《消毒试验用微生物要求》
3. GB/T 18281.1-2024《医疗保健产品灭菌 生物指示物 第 1 部分：通则》（等同采用 ISO 11138-1:2017，代替 GB 18281.1-2015，2025-12-01 实施）：活菌数 50%~300% 判定、D 值 ±20% 复测限、抗力测定方法组合
4. ISO 11138-7：含菌量验证应遵循制造商提供的方法与材料
5. 《中国药典》2025 年版四部通则 1105 微生物计数法
6. 国内生物指示剂制造商（泰林生物等）公开技术资料：热激活 95~100℃ 15 分钟条件、玻璃珠 4~6 mm 打散、稀释液对计数结果影响的比对数据（厂商经验口径，执行时以所用产品制造商方法为准）
本文所引标准与规范均以现行有效版本为准；具体操作条件与判定限值在实际执行中，以所属领域的标准现行文本、产品制造商说明书及本实验室经验证的程序为依据。
客服1