作者：杭州沐昀科技有限公司阅读对象：灭菌验证工程师、设备确认（IQ/OQ/PQ）专员、无菌与终端灭菌制剂生产企业 QA/QC，以及负责蒸汽灭菌柜公用系统维护的工程人员。
蒸汽灭菌柜——尤其是脉动真空压力蒸汽灭菌器——的无菌保证，远不止"把温度拉到 121 ℃"那么简单。空气有没有排尽、真空脉动是否到位、最难灭菌位置是否被生物指示剂（BI）真正挑战到，决定了放行结论是否站得住脚。本文把 B-D 测试、真空脉动（含泄漏率）与 BI 挑战布置三条主线串起来，给出一套可在 OQ/PQ 中直接落地的操作框架，并说明它们与 生物指示剂为什么是灭菌验证的"金标准" 之间的内在关系。
一、为什么蒸汽灭菌柜要专门做 BI 挑战
终端灭菌以取得无菌保证水平（SAL）10⁻⁶ 为目标，即灭菌后单件产品含活微生物的概率不大于百万分之一。饱和蒸汽之所以能实现这一水平，靠的是高温（如 121 ℃ / F₀≥15）与微生物死亡动力学的叠加；但"温度够"只是必要条件，不是充分条件——如果腔体内存在空气残留、冷凝水或装载死腔，蒸汽就无法均匀穿透，局部温度会低于设定值，BI 也就没有被真正挑战。
因此，蒸汽灭菌柜的验证是一个"先证明设备能把空气排干净、再把最难位置用 BI 打满"的递进过程：灭菌验证中的 IQ/OQ/PQ 与 PCD 选择 决定了框架，B-D 测试与真空脉动负责"空气移除"，BI 挑战布置负责"难点命中"。三者缺一则放行证据链不完整。
二、B-D 测试：空气移除的"每日哨兵"
B-D 测试（Bowie-Dick Test）专门用于检验预真空 / 脉动真空灭菌柜的冷空气移除效率与蒸汽穿透均匀性。下排气（重力置换）灭菌柜依赖蒸汽自然驱赶空气，通常不强制做 B-D 测试；而预真空/脉动真空柜一旦真空泵、管路或门封异常，残留空气会聚集在腔体顶部或装载死腔，导致"显示温度到了、实际没灭透"。
标准做法是用符合 ISO 11140-4 的 Class 2（B-D 型）指示物（一次性 B-D 测试卡或标准测试包），在每日首锅生产装载前空载执行一次（部分 SOP 要求每锅一次）。判读看指示物颜色是否均匀变化、有无残留浅斑；浅斑或明显不均匀即判不合格，须停用排查。
| 项目 | 要点 |
|---|---|
| 适用对象 | 预真空 / 脉动真空灭菌柜（下排气柜不强制） |
| 执行频次 | 每日首锅（或每锅，依 SOP）前空载执行 |
| 测试物 | 标准 B-D 测试包 / 一次性 B-D 测试卡（ISO 11140-4 Class 2） |
| 判读 | 指示物颜色均匀变化、无残留浅斑 |
| 接受标准 | 按 ISO 11140-4、EN 285、GB 8599；浅斑/不均匀即不合格 |
| 不合格处置 | 不得装载生产，排查空气残留 / 真空 / 门封泄漏 |
B-D 测试是"哨兵"而非"放行证据"：它只证明该锅次的空气移除能力合格，并不替代装载下的 BI 挑战。关于指示物的分类与选用，可结合 灭菌方式选型指南 中不同灭菌工艺的确认逻辑一并理解。
三、真空脉动与泄漏率：蒸汽穿透的前提
脉动真空灭菌柜通过反复"抽真空—进蒸汽"的多个脉冲，把腔体与装载中的空气置换出去。脉动的关键参数包括极限真空度、脉动次数与保压泄漏率：真空度不足或泄漏率偏高，意味着抽不净、保不住，残留空气会随蒸汽进入装载死腔。
泄漏率（真空保持试验）是 OQ 的硬性关卡：在抽至规定真空度后保压，观察压力回升。常见口径要求保压期内压力回升 ≤ 0.13 kPa/min（约 1.3 mbar/min），但具体限值以 EN 285《蒸汽灭菌器——大型灭菌器》与设备厂家 IQ 文件为准，不同腔体容积口径略有差异。真空脉动与泄漏率直接决定蒸汽能否穿透到 BI 所在的最难点，是 BI 挑战成立的前置条件。
| 项目 | 典型指标（以设备 IQ / 适用标准为准） |
|---|---|
| 脉动极限真空度 | 多脉冲抽至 ≤ −80 kPa（约 0.8 bar 绝压）或厂家设定值 |
| 脉动次数 | 3–6 次（依装载几何与设备型号） |
| 泄漏率（真空保持） | 保压期压力回升通常 ≤ 0.13 kPa/min（EN 285 / GB 8599 口径），以 IQ 文件为准 |
| 与 BI 的关系 | 空气残留 → 蒸汽无法穿透 → BI 挑战失败、出现阳性 |
四、生物指示剂怎么选：菌株、D 值与数量
蒸汽灭菌的参考 BI 菌株是嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus，曾用名 Bacillus stearothermophilus），常用公证保藏编号 ATCC 7953 / ATCC 12980（亦见 NCTC 10007、CIP 52.81 等）。该菌嗜热、抗湿热的 D 值高，是蒸汽灭菌最严苛的挑战菌株。菌株命名与分类沿革见 蒸汽灭菌生物指示剂菌株命名辨析。
选 BI 时真正要盯紧的是三个参数：芽孢数（N₀）、D 值、Z 值。蒸汽灭菌 BI 的 D₁₂₁通常约 1.5–3.0 min，标称芽孢数多为 ≥ 10⁶；具体以 D 值、Z 值与芽孢数 的方法学为准，并以 D 值复核与实验室内部确认 验证标称值是否可信。需要特别提示：BI 的 D 值与芽孢数应在来料时按 质量控制（制造商视角） 的思路做 COA 复核与批间一致性确认，避免用错批或过期指示剂。
| 关注点 | 说明 |
|---|---|
| 菌株 | Geobacillus stearothermophilus（ATCC 7953 / 12980 等） |
| D₁₂₁ | 约 1.5–3.0 min（以 COA 标称与复核为准） |
| 芽孢数 N₀ | 通常 ≥ 10⁶，过度杀灭法下作为挑战基数 |
| 形态 | 载体型 / 自含式均可，依 PCD 与装载选择 |
五、BI 挑战布置：难点定位与 PCD
BI 挑战布置的核心只有一句话：把 BI 放在"最难灭菌"的位置，并让它接受不弱于最难点产品的挑战。难点位置来自 OQ 阶段的温度分布研究（热电偶布点），通常就是装载几何中的"冷点"——如腔体角落、密集堆叠中心、管腔/过滤器深端。BI 不应只在随手可及处摆样，而要进入这些最差位置。
为把挑战标准化，常用 PCD（Process Challenge Device，工艺挑战装置）：一个其抗性不低于最难点产品的装置，BI 封装其中，使每批挑战可重复、可比较。装载模式（满载/典型装载）也须固定，因为空柜与满载的冷点不同。每个确认点应设阳性对照（同批 BI 不灭菌培养）以证明 BI 本身有活性。
| 布置位置 | 数量建议 | 接受 | 说明 |
|---|---|---|---|
| 冷点（温度分布最差） | ≥ 1 | 无菌生长 | 由热电偶分布研究确定 |
| PCD 内 | ≥ 1–2 | 无菌生长 | 挑战 ≥ 最难点产品 |
| 装载几何最难处 | 依装载定 | 无菌生长 | 管腔 / 密集堆叠 / 过滤器 |
| 阳性对照 | 1 | 应生长 | 同批 BI 未灭菌对照 |
六、OQ/PQ 实施与半周期法
在 灭菌验证的 IQ/OQ/PQ 框架 中，BI 挑战主要落在 OQ（确认设备能力）与 PQ（连续三批工艺确认）。对过度杀灭法（overkill），常用半周期法（half-cycle）：先求出能使 BI 种群获得 ≥ 6 log 减少（即杀灭标称芽孢数并留安全余量）的最短灭菌时间，将其加倍作为正式周期；再叠加对生物负载的 6 log 削减，整体达到 SAL 10⁻⁶。BI 在半周期与全周期中的布置位置必须一致。
PQ 阶段按既定装载连续运行三批，每批在最难点与 PCD 内放置 BI，全部无菌生长且阳性对照生长，方可确认工艺稳定。任何一批 BI 阳性都须启动偏差调查，而非简单重做。
七、常见偏差与排查清单
BI 挑战出现阳性，或 B-D 测试不合格时，按"设备—装载—指示剂—方法"四轴排查：
- 设备侧：真空泵性能、脉动次数/真空度是否达标、门封与管路泄漏率是否超标（回到 B-D 与第三节）；疏水阀、蒸汽干度是否合格。
- 装载侧：是否超载、堆叠过密、管腔未开口、冷点位置与 BI 布置是否偏离 OQ 确认。
- 指示剂侧：BI 是否过期、COA 与批号是否匹配、运输冷链是否达标（参见质量控制与来料确认）。
- 方法侧：培养条件（温度/时间）、判读是否规范、阳性对照是否同步生长以排除 BI 失活假阴性。
排查逻辑与 阳性结果调查与偏差处理 一致：先区分真阳性（灭菌不足）与假阳性（污染/判读错误），再决定是工艺整改还是方法纠正。
八、小结
蒸汽灭菌柜的无菌保证是一条证据链：B-D 测试守每天空气移除的入口，真空脉动与泄漏率决定蒸汽能否穿透，BI 挑战布置（冷点 + PCD + 阳性对照）在最难点上给出放行证据。三者嵌套在 IQ/OQ/PQ 框架内，并以半周期法衔接 SAL 10⁻⁶ 的目标。把它们做扎实，蒸汽灭菌的放行才真正"站得住脚"。
法规依据说明：本文涉及的技术要求主要参照 ISO 11140-4（化学指示物，含 B-D 型 Class 2）、ISO 11138 系列（生物指示剂）、EN 285《蒸汽灭菌器——大型灭菌器》、GB 8599《大型蒸汽灭菌器 技术要求》、GB/T 18281（生物指示物）以及《药品生产质量管理规范（GMP）》无菌药品附录关于灭菌验证与 BI 使用的原则。具体限值（如泄漏率、脉动真空度、D 值）以设备厂家安装确认（IQ）文件、最新版标准与当地法规为准；本文为科普性技术梳理，不作为验证方案的逐项依据。
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