作者：杭州沐昀科技有限公司技术团队 阅读对象：微生物实验室负责人与 QC 微生物检验人员、QA 与文件体系负责人、BI 来料验收与供应商质量管理（SQE）人员、菌种库管理员，以及正在建立或完善"标准菌株—工作菌株"管理体系的无菌保障团队
每一支生物指示剂（BI）的判定结论，最终都落在同一件事上：那几十万到上百万个芽孢，是不是名副其实的"标准菌株"。芽孢数可以数、D 值可以测，但如果挂载的菌株本身身份不清、代次失控、活性衰退，那么再精密的培养与判读也只是对一堆"来历不明"的微生物做记录。企业自制挑战菌株（例如在方法学验证、生长促进试验、消毒剂效能验证中自行使用的芽孢悬液）的风险尤其集中：它不像商品化 BI 有制造商的批次放行背书，菌株管理链条完全暴露在自己实验室的体系之下。
实务里最常见的问题不是"没有管理"，而是管理停在口头：冰箱里有一排冻存管，但哪一支是第几代、从哪一管传出来的，只有操作人自己知道；标准菌株从 ATCC 买回来直接当工作菌株用，中间没有验收记录；复苏后不做生长确认，直接用于挑战试验，结果"该长的不长"，偏差调查又查不出原因。
本文按管理链条讲六件事：菌株的来源与验收、种子批与保藏体系、传代代次的计数规则、复苏与生长促进验证、菌株台账与记录、常见缺陷与自查清单。核心结论先说：菌株管理的全部要求，归结起来就是让每一支在用菌株都能回答四个问题——我是谁（身份）、我从哪来（溯源）、我第几代（代次）、我还活着吗（活性与效期）。答不出任何一条，用它做出的所有微生物学结论都应打上问号。
一、为什么 BI 的"根"在菌株管理：一条必须讲清身世的链
BI 的质量属性清单里，芽孢数、D 值、Z 值这些"硬指标"都是结果，而它们的源头是菌株本身。嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）与枯草杆菌黑色变种等菌株的命名与株号辨析之所以值得专门写一篇，正是因为株号与命名是菌株身份的第一层证据——名称写错、株号混用的 BI，其所有后续数据都失去了对照基准。
监管与标准对这条链条的要求是明确的。中国药典通则"药品微生物实验室质量管理指导原则"要求，实验室应建立标准菌株/标准培养物的保存、传代与使用程序，标准储备菌株传代次数应受控（通常不超过 5 代）；ISO 11138 系列要求 BI 制造商使用经过鉴定（identity）确认的菌株，并保持株号与来源可追溯；USP 相应通则同样要求采用种子批（seed lot）体系管理标准培养物，并对工作培养物的代次作出限制。
把要求翻译成一条链，就是：
| 链条层级 | 含义 | 典型形态 | 管理要点 |
|---|---|---|---|
| 标准菌株（参考菌株） | 有权威来源证明的原始菌株 | ATCC / CICC / CMCC 冻干管，附 COA | 来源证书、批号、入库验收 |
| 标准储备菌株（原始种子批） | 由标准菌株首次复苏后制成的母批 | -70℃ 以下冻存或冻干，分装备用管 | 首次扩培即算传代，代次从 0 起 |
| 储备菌株（工作种子批） | 由标准储备菌株扩培成的分装批 | 冻存管或冻干管，标注代次 | 每传一代代次 +1，≤5 代 |
| 工作菌株 | 日常试验直接使用的菌株 | 斜面、平板或培养物悬液 | 用前特性确认，用后不回存 |
这条链对 BI 使用方同样重要：即使企业不自制 BI，在生长促进试验、消毒剂/杀孢子剂效能验证、环境菌鉴定、替代方法验证中使用的标准菌株，也必须满足同样的管理要求——检查员通常不会区分"这是 BI 的菌株"还是"这是方法学的菌株"，看的就是同一套体系。
二、标准菌株的来源与验收：批号、COA 与溯源起点
溯源链条的起点是"买对人"。可用的来源分三类：国际权威保藏机构（ATCC、DSMZ、NCTC 等）、国内法定保藏机构（CMCC 中国医学细菌保藏管理中心、CICC 中国工业微生物菌种保藏管理中心等）、以及有资质的商业衍生供应商。三类都可以用，但证据链必须连续：商业供应商提供的衍生菌株，应能提供向权威机构的溯源证明或等效的鉴定报告。
到货验收是溯源链条的第一个动作，建议固定为四步：
- 核对实物与证书：菌株名称、株号（如 ATCC 12980）、批号、状态（冻干/活力）、保质期与 COA 一致；株号与订货单一致——这是最容易出错的一步。
- 检查运输与包装：冻干安瓿/西林瓶无裂纹、真空封口完好；对温度敏感的形态需核查冷链记录。
- 首次复苏并鉴定：按说明书复苏后，应做菌落形态、染色反应，并结合生化鉴定或快速鉴定系统确认到"种"（必要时到"株"），确认结果与证书一致后方可进入种子批制备。
- 登记入库：录入菌种台账，赋予唯一编号，COA 与鉴定记录归档为该菌株的"出生证明"。
验收环节最容易被省略的是"首次鉴定"——很多实验室默认"买的假不了"。但冻干菌株在运输中的损伤、标签错发、甚至供应商批次混料，历史上都发生过。一次十几分钟的鉴定，换来的是整个种子批体系的可信起点，这笔账是划算的。
三、种子批与保藏体系：怎么存，才能少传代、不衰退
种子批体系的目标只有一个：让标准菌株尽量"停在原地"，而不是在一次次传代中漂移。实现方式是把一次复苏的价值最大化——复苏一次，制备足够多的分装管，之后所有需求都从冻存管取用，而不是反复从平板传代。
常见的保藏方式对比：
| 方式 | 典型条件 | 优点 | 局限 |
|---|---|---|---|
| 冻干（冷冻干燥） | 2–8℃ 避光 | 保存期长（数年），便于分发与运输 | 制备成本高，复苏有损伤，分装后不宜反复开启 |
| 超低温冻存（甘油/脱脂牛奶悬液） | -70℃ 及以下 | 制备简便，活菌数稳定，取用灵活 | 依赖冰箱可靠性，需温度监控与断电预案 |
| 斜面/穿刺（短期） | 2–8℃ | 取用直接 | 仅限短期，代次增长快，不宜作为储备 |
| 商品化定量复苏培养物 | 按供应商说明 | 浓度可量化、即用型 | 仍需纳入台账并做接收确认 |
对 BI 相关实验室（G. stearothermophilus、B. atrophaeus 等芽孢形成菌），还有一条实务提醒：储备菌株的复苏与扩培条件要兼顾芽孢形成能力。菌株保藏的是活性，而 BI 关心的是芽孢的抗力特性——如果扩培时使用了不利于 sporulation 的条件，后续制备的芽孢悬液可能出现 D 值偏移。因此储备菌种的扩培培养基、温度与时间应写成固定程序，不要每次"随手换一种培养基"。
保藏体系的硬件要求常常被低估：每一台存储冰箱/冰柜都应有连续温度监控与报警、断电应急方案、设备确认（温度分布）记录。一排没有温度记录的 -70℃ 冰箱，在审计里等同一排"状态不明的种子批"。
四、传代管理：代次怎么数、限值怎么定
"传代不超过 5 代"是被引用最多的菌株管理规则，但也是数错最多的一条。数错的根源是没把计数起点和计数事件定义清楚。
- 计数起点：从标准菌株首次复苏、制备标准储备菌株开始计 0 代（也有企业将权威机构发出的冻干株计为第 0 代，从首次复苏扩培计 1 代——两种口径都可接受，但必须写进程序并全所统一）。
- 计数事件：每发生一次"从上一代培养物转接到新培养基并形成新批次培养物/分装"，代次加 1。同一储备管复苏出的一批工作平板属于同代次，不算互相传代。
- 限值：工作菌株从储备菌株传出的代次通常限 ≤5 代；达到限值的菌株转作非关键用途（教学、演示）或废弃，不得再用于正式试验。
- 禁止回传：工作菌株剩余培养物不得回存入种子批——"用剩下的倒回冻存管"是审计里最经典的缺陷。
一个直观的代次推演：
| 动作 | 代次变化 | 说明 |
|---|---|---|
| ATCC 冻干管复苏 | — → 0 代 | 形成标准储备菌株（原始种子批） |
| 0 代分装管复苏扩培，制成工作种子批 | 0 → 1 代 | 分装备用管，标注 1 代 |
| 1 代储备管复苏，转接斜面供日常使用 | 1 → 2 代 | 斜面即工作菌株（2 代） |
| 2 代斜面再转接一次平板用于试验 | 2 → 3 代 | 3 代，仍在限值内；斜面废弃，不回存 |
| 3 代起再扩一批储备 | 3 → 4 代 | 允许，但应评估是否重新启用新的 0 代管更经济 |
实务建议是"两条腿"：代次台账（每管冻存/冻干标注代次与制备日期）加代次推演规则（写清楚什么动作加一代）。只贴标签不写规则，换一个人接手就会数错；只写规则不贴标签，谁来都得靠猜。
五、复苏与生长促进：活性验证的三道关
保藏解决"存得住"，复苏验证解决"活得活"。从一支冻存/冻干管到可用于试验的工作菌株，建议设三道关：
第一道：复苏确认。复苏后观察生长情况（生长速度、菌落形态、颜色与边缘特征是否典型），做革兰染色与必要的生化或快速鉴定。对芽孢形成菌，还应在标准芽孢形成条件下确认芽孢形成能力——这一点常被遗漏，但对 BI 类应用是硬要求。
第二道：特性保持确认。对用于定量挑战的菌株，应确认复苏后菌株的关键特性未漂移：菌落典型性、生长动力学正常；对进阶应用（如自制芽孢悬液用于方法学验证），还应周期性复核抗力特性（D 值确认可参照 D 值复核与实验室内部确认的思路执行），并与标称值或历史基线比较。
第三道：使用前活性确认（生长促进）。凡是用菌株做"阴性/阳性对照""抑菌效力""生长促进试验"的场景，使用时培养基必须证明能支持该菌株生长——这与 培养基与培养判读中的促生长试验是同一逻辑：菌株合格不等于组合合格，菌株放进特定培养基、特定培养条件后仍然要证明"能长"。
三道关都应留下可复核的记录：复苏日期、鉴定方法与结果、菌落描述、生长促进结论、复核人。没有记录的确认，在审计眼里等于没有发生。
六、菌株台账与记录：四个问题一张表答清
前文说过，菌株管理的终点是让每支在用菌株答清四个问题：身份、来源、代次、活性。落到载体上，就是一张菌株台账加两类标签。
台账建议覆盖以下字段（可按需增减，但核心字段不可缺）：
| 字段 | 对应问题 | 示例 |
|---|---|---|
| 内部唯一编号 | 身份 | GST-2024-01 |
| 菌名与株号 | 身份 | Geobacillus stearothermophilus ATCC 12980 |
| 来源与批号 | 来源 | ATCC，批号 XXXX，COA 编号 |
| 代次 | 代次 | 2 代（制备自 1 代储备管 GST-2024-01-S2） |
| 制备日期与失效原则 | 活性 | 制备 2024-05-10；-70℃ 保存，无固定效期、按活性确认放行 |
| 活性确认记录 | 活性 | 复苏确认、生长促进、抗力复核记录编号 |
| 领用/传代记录 | 代次与来源 | 日期、用途、操作人、剩余代次额度 |
| 处置记录 | 身份 | 废弃日期与方式（高压灭菌等） |
两类标签：存储标签贴在冻存/冻干管上（编号、菌名、代次、制备日期、保存条件），工作标签贴在斜面/平板上（编号、代次、转接日期、效期或活性确认信息）。标签信息应与台账逐字一致——"台账一套、标签另一套"的实验室，几乎一定会在某一天出现"幽灵代次"。
与计量溯源的关系也值得一说：从标准菌株到工作菌株的量值传递与可追溯闭环一文把菌株溯源与标准物质的计量溯源做了对照——两者共享同一套思想：源头有证书、过程有记录、每一步可回放。BI 制造商视角的菌株批次放行实践可参见 生物指示剂质量控制（制造商视角），而菌株身份确认在阳性调查中的反向应用（区分目标菌、环境菌与实验室污染）可参见 BI 培养阳性菌鉴定与污染溯源。
七、常见缺陷与自查清单
以下八类是菌株管理相关的高频缺陷（无论日常自查还是外部审计都值得逐条对照）：
- 株号与名称混用：COA、台账、BI 标签上同一菌株写法不一致，株号缺失或写错。
- 验收无鉴定：新购标准菌株直接入库启用，无首次复苏鉴定记录。
- 代次无规则：程序未定义"什么动作算传一代"，不同人员计数口径不一。
- 幽灵代次：标签代次与台账对不上，或台账缺传代记录。
- 工作菌株回存：剩余培养物倒回储备管，储备批被污染或代次失真。
- 超代使用：>5 代菌株仍用于正式试验，且无风险评估。
- 存储无监控：-70℃ 冰箱无连续温度记录、无断电预案、无确认记录。
- 活性只靠"上次"：菌株用前不做生长促进/特性确认，引用几个月前的历史结果。
对应的自查清单：
- 在用菌株是否都能在 5 分钟内答清"身份、来源、代次、活性"四个问题？
- 每支标准菌株是否有 COA 或等效溯源证明，且株号与台账一致？
- 首次入库是否做了复苏鉴定，鉴定方法与结果是否归档？
- 程序是否写明代次计数起点与计数事件，全员口径是否一致？
- 冻存/冻干管与工作标签信息是否与台账逐字一致？
- 是否存在工作菌株回存种子批的操作路径（哪怕口头习惯）？
- 代次额度是否有预警（如第 3 代起提示、第 5 代禁用）？
- 存储设备是否有温度连续监控、报警处置与断电预案记录？
- 扩培与芽孢形成条件是否固化为程序，而非随操作人变化？
- 用于定量的菌株是否有特性保持/抗力复核的计划与记录？
- 生长促进试验是否覆盖实际使用的培养基与培养条件组合？
- 废弃菌株的处置方式与记录是否明确？
- 菌种库管理员是否有明确授权与备份人员？
- 台账是否定期与实物盘点核对（建议每年）？
- 偏差或异常生长是否触发"冻结相关种子批"的调查动作？
结论一句话：生物指示剂给出的每一个"阴性/阳性"，都是对某株特定微生物的一次裁决；而裁决的权威性，取决于这株微生物的身世是否讲得清。把来源、代次、保藏、复苏四件事做成有记录、有标签、有人负责的日常动作，菌株就从体系里最隐蔽的风险点，变成了审计中最能加分的证据链。
法规依据说明：本文涉及的主要文件包括中国药典 2025 年版通则（灭菌法、药品微生物实验室质量管理指导原则、微生物限度/无菌检查相关通则中关于标准菌株与传代管理的要求）、ISO 11138 系列（生物指示剂通用要求及各分部）、ISO 11138-1（通用要求中对菌株鉴定与溯源的要求）、ISO 14161（生物指示剂选择、使用与结果解释指南）、ISO/IEC 17025（实验室管理体系对标准物质管理的要求）、USP 相应通则（标准培养物与种子批管理、微生物检验方法验证）、EU GMP Annex 1（无菌药品，污染控制策略中微生物学证据部分）与 PDA TR 相关技术报告。文中代次限值、保存条件与确认频次为行业常见实践口径，具体应以所适用药典与标准的现行有效版本、企业程序文件及菌株供应商说明书的规定为准；本文不替代法规原文，也不构成对特定实验室或体系的合规判定。
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