引言
无论是病毒扩增、保存复苏还是下游实验，都需要知道一份病毒储备液里含有多少具有感染性的病毒，这正是滴度测定要回答的问题。依据扩增宿主和病毒特性的不同，常用的滴度测定方法有三种：噬斑测定（结果以 PFU 表示）、组织培养感染剂量（TCID50）与鸡胚感染剂量（EID50）。本文依据 ATCC《Virology Culture Guide》整理三种方法的原理、操作要点与关键参数，并给出 TCID50 与 PFU 之间的换算关系，供病毒实验室参考。
一、噬斑测定（Plaque Assay）
原理：测量单个感染性病毒在宿主细胞单层上形成噬斑的能力。噬斑是病毒感染周期中宿主细胞死亡的结果：一个感染性病毒颗粒经过吸附、增殖与扩散，最终在单层上形成一片可见的细胞死亡区。
依据 ATCC 指南，操作要点如下：
1）在培养皿中培养宿主细胞至适当汇合度；
2）去除生长培养基，用 DPBS 洗涤，将系列稀释的病毒加入各孔，每个稀释度设多个孔；
3）孵育 1~2 小时，使病毒充分吸附；
4）去除接种物，必要时用基础培养基洗涤；
5）覆盖覆盖培养基（overlay），孵育适当时间，必要时去除覆盖物；
6）每天观察单层上的病灶或噬斑；
7）计数含 20 个以上噬斑的培养皿：平均噬斑数 × 病毒稀释度 = 每体积接种物的噬斑形成单位（PFU），即病毒滴度。
ATCC 指南同时提示，噬斑测定的更多细节可查阅《A Manual of Basic Virological Techniques》（Prentice-Hall Inc.）与《Virology Methods Manual》（Academic Press, 1996）。
二、TCID50（组织培养感染剂量）
原理：通过终点稀释法，测定能引起 50% 接种细胞培养物产生病变（CPE）的病毒稀释度。相比噬斑法，TCID50 不要求病毒形成清晰可见的噬斑，因此适用范围更广。
依据 ATCC 指南，操作要点如下：
1）准备推荐细胞系的培养板（最好与扩增所用细胞相同），孵育至最佳感染密度；
2）在基础培养基中制备病毒系列稀释液；
3）去除生长培养基，可洗涤单层以去除抑制因子；
4）每个稀释度接种至少 3 个孔，同时以基础培养基作阴性对照，每个稀释度使用新的无菌移液管；
5）孵育 1~2 小时，使病毒吸附；
6）加入病毒生长培养基，在适当条件下孵育，每天观察并记录；
7）终点判定：CPE 或免疫荧光检测（IFA）读数在 3 次独立读数中一致时确定；
8）使用 Reed-Muench 方法计算滴度。
其中「每个稀释度使用新的无菌移液管」这条细节很重要：它能避免高浓度稀释液被携带到低浓度孔，防止终点读数失真。
三、TCID50 与 PFU 的换算
两种方法的结果可以粗略换算。依据 ATCC 指南，基于泊松分布推导：P(o) = e-m；当滴度以 TCID50 表示时，P(o) = 0.5，对应 m ≈ 0.7，由此得到：
PFU/mL ≈ TCID50/mL × 0.7
举例来说，1×10⁵ TCID50/mL 的材料，预计约产生 0.7×10⁵ PFU/mL。
需要提醒的是，这个换算是估算值。两种方法测定的对象和统计含义并不相同，实际 PFU 数应通过噬斑实验确定，换算结果仅作参考。
四、鸡胚感染剂量（EID50 / CEID）
适用对象：在鸡胚中扩增的病毒（如流感病毒）。原理：将病毒系列稀释后接种鸡胚，孵育后收获尿囊液，通过血凝反应（HA）判断各稀释度是否存在病毒。
依据 ATCC 指南，操作要点如下：
1）订购适当日龄（8~12 天）的鸡胚，放入适当温度的孵化器，旁边放水盘保湿；
2）照蛋定位气室和胚胎并标记；在生物安全柜中于气室区域打孔（胚胎眼部对侧），将系列稀释病毒接种到尿囊腔，指甲油密封；
3）接种后 24 小时照蛋检查病毒诱导的死亡，死胚放入生物危害袋；
4）推荐孵育期结束后收获病毒，存活胚胎先置于 4℃ 至少 2 小时处理；
5）准备 0.5% 鸡红细胞悬液（PBS 配制），将每枚蛋的尿囊液加入 96 孔圆底板不同孔，每个稀释度使用新移液管；
6）每孔加入 1:1 比例的 0.5% 红细胞悬液，轻拍混匀，室温静置 30~45 分钟后读数：阴性孔红细胞呈「纽扣状」沉于孔底，阳性孔红细胞呈「晶格状」凝集；
7）终点为产生阳性结果的最高稀释度，例如 HA = 1:640 表示血凝终点为 1:640。
照蛋小知识：存活鸡胚的尿囊膜内有小血管，照蛋可见；胚胎眼部看起来像移动的黑点。
五、三种方法对比一览
| 维度 | 噬斑法（PFU） | TCID50 | 鸡胚感染剂量（EID50） |
|---|---|---|---|
| 测定原理 | 单个感染性病毒在细胞单层上形成噬斑的能力 | 终点稀释法：50% 接种培养物出现病变的稀释度 | 系列稀释接种鸡胚，以血凝反应判断感染 |
| 结果单位 | PFU（每体积接种物的噬斑形成单位） | TCID50/mL（Reed-Muench 法计算） | EID50，同时常报告血凝终点（如 1:640） |
| 适用对象 | 能形成清晰噬斑的病毒 | 多数组织培养适应型病毒，包括噬斑不明显的病毒 | 鸡胚扩增病毒（如流感病毒） |
| 关键参数 | 每个稀释度多孔；计数含 20 个以上噬斑的培养皿；吸附 1~2 小时 | 每个稀释度至少 3 孔；终点经 3 次独立读数一致确认；每稀释度换新移液管 | 8~12 日龄鸡胚；0.5% 鸡红细胞；1:1 混合，室温 30~45 分钟读数 |
| 方法特点 | 直观反映感染性颗粒数量 | 通用性强，不依赖噬斑形成 | 不依赖细胞培养设施，判读依赖血凝反应 |
六、怎么选择测定方法
三种方法各有适用场景。病毒能在细胞单层上形成清晰噬斑时，噬斑法结果直观，直接反映感染性颗粒数量；病毒噬斑不明显或需要更通用的方案时，TCID50 配合 Reed-Muench 计算是常规选择；流感等在鸡胚中扩增的病毒，则以鸡胚感染剂量配合血凝反应判读为主。
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常见问题
说明与主要参考来源
ATCC《Virology Culture Guide》Viral Titering 章节（atcc.org）；《A Manual of Basic Virological Techniques》，Prentice-Hall Inc.；《Virology Methods Manual》，Academic Press, 1996（后两种为 ATCC 指南引用的噬斑测定延伸读物）。
本文依据 ATCC 官网公开资料整理，仅供科研与技术参考，不构成实验操作规程。文中操作细节、参数与判定标准请以所购产品的说明书（Product Sheet / COA）及 ATCC 官方 PDF 指南为准。涉及感染性材料的操作须在具备相应生物安全等级的设施中进行，并遵守所在机构与国家的生物安全法规。
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