引言
病毒储备液的价值在于可重复使用，而保存方式直接决定储备液的寿命。先说核心结论：冷冻通常会导致病毒活力和滴度下降，因此保存策略要按病原体类型区分：细胞相关病原体缓慢冷却，非细胞相关病毒快速冷冻，长期保存优先选择液氮气相（低于 -120℃）。本文依据 ATCC《Virology Culture Guide》，整理冷冻保存与冻干保存的适用场景、关键参数与特定毒株的保存策略。
一、为什么要做病毒保存
依据 ATCC 指南，保存储备液的意义有四点：
1）防止储备液因设备故障或污染而丢失；
2）节省维持不常用毒株的时间与成本，不必为偶尔使用的毒株持续传代；
3）防止表型漂移：持续传代带来的遗传不稳定和选择压力会改变毒株特性，保存可以冻结这一过程；
4）创建可用于系列实验的标准试剂，保证批次间一致性。
二、冷冻保存：核心原则与两条路径
核心原则：冷冻病毒悬浮液通常导致活力和滴度下降。减轻损伤的方式因病原体类型而异：
1）细胞相关病原体（衣原体、立克次体等）：应缓慢冷却，通常为 -1℃ 至 -10℃/分钟，让细胞内水通过渗透排出，减轻冰晶损伤；可添加冷冻保护剂（甘油或 DMSO）；
2）非细胞相关病毒：应快速冷冻（浸入干冰浆），储存在液氮气相或 -80℃ 机械冷冻箱。
冷冻保护剂方面，甘油和 DMSO 最常见，ATCC 常用 FBS 与 DMSO 或甘油的混合体系；只使用试剂级 DMSO 和甘油，分装避光储存。
下面是 ATCC 指南列出的部分冷冻制备示例：
| ATCC 编号 | 产品名称 | 制备方法 |
|---|---|---|
| VR-1 | 人腺病毒 1 型 | 感染培养液 |
| VR-343 | 日本脑炎病毒 | 感染培养液与小牛血清 1:1 稀释 |
| VR-977 | 人疱疹病毒 5 型 | 感染培养液（EMEM + 10% FBS + 7% DMSO） |
| VR-897 | 甲型流感病毒（H1N1） | 感染尿囊液 |
| VR-955 | 人呼吸道合胞病毒 | 感染培养液（EMEM + 2% FBS） |
| VR-156 | 痘苗病毒 | 感染培养液（L-15 + 2% FBS + L-谷氨酰胺） |
| VR-612 | 小株立克次体 Rickettsia akari | 感染卵黄囊在蔗糖-磷酸-谷氨酸中 1:1 稀释 |
三、设备与储存要点
1）冻存管：玻璃管需灭菌并火焰密封，打开困难但密封后安全性高；塑料管分内螺纹（配硅胶垫圈，需拧到恰到好处）与外螺纹两种；
2）程序降温设备：计算机控制的电子冷冻单元可精确维持 -1℃/分钟（ATCC 唯一使用的方法）；低成本方案包括无醇冷冻容器（如 CoolCell LX，ATCC ACS-6000，于 -70℃ 冷却 24 小时），或壁厚 15 mm、容量 1 L 的聚苯乙烯盒内填纸、棉毛或泡沫；
3）液氮储存：分液相与气相两种系统，ATCC 强烈推荐气相储存。原因在于：液相可能进入密封不良的冻存管，取出时可能爆炸；气相系统存在垂直温度梯度，应关注顶部温度保持在 -120℃ 或更低；所有系统应配备温度报警器。
四、两种冷冻程序与复苏要点
非控制冷冻（快速冷冻）：收获后分装安瓿瓶，浸入干冰/乙醇浴快速冷冻，储存于液氮气相或 -80℃ 冷冻箱。适用于非细胞相关病毒。
控制冷冻（衣原体、立克次体等细胞相关病原体），依据 ATCC 指南共七步：
1）按推荐条件孵育至最大产量（如适用，最大 CPE）；
2）加入冷冻保护剂（通常 FBS 与 DMSO 或甘油混合）；
3）在生物安全柜中分装 0.5~1.0 mL 到无菌塑料冻存管或玻璃安瓿瓶，玻璃安瓿瓶用气体-氧气火炬密封并消毒；
4）放入预冷（4℃）的控制速率冷冻室，置 -70℃（或更低）至少 24 小时；或用可编程冷冻单元以 -1℃/分钟降至 -40℃ 以下，再骤降至 -120℃；
5）快速转移至液氮或 -120℃ 冷冻箱；
6）记录冷冻位置和详情；
7）-120℃ 下 24 小时后取出一管进行活力检测和无菌检查。
冷冻病毒复苏：提前培养推荐生产宿主（培养基平衡温度和 pH），37℃ 水浴轻摇，快速解冻至所有冰晶融化（约 2 分钟），70% 乙醇消毒后拧开管盖按说明书接种，孵育适当时间后检查培养物。
五、冻干保存
原理：通过升华从冷冻产品中去除水和其他溶剂，分三步：预冷冻、初级干燥（去除大部分水）、次级干燥（去除结合水）。缓慢冷却可形成垂直冰晶结构，利于水分更高效升华。
冻干产品的性质：吸湿性强，储存须防潮；对氧气和温度敏感，应在冷藏温度（4℃）储存。
现状提示：ATCC 目前不使用冻干保存病毒，部分病毒冻干后活力会丧失，强烈细胞相关的病毒（如带状疱疹病毒）在宿主外即失去活力；但冻干在历史上曾被广泛使用，部分毒株仍以冻干形式提供。
冻干前需加入保护性添加剂，如葡萄糖、脱脂乳或蔗糖-磷酸-谷氨酸-白蛋白（SPGA）。ATCC 指南列出的冻干制备示例：
| ATCC 编号 | 产品名称 | 制备方法 |
|---|---|---|
| VR-343 | 日本脑炎病毒 | 感染原代仓鼠肾细胞 + 50% 小牛血清 |
| VR-90 | 科罗拉多蜱热病毒 | 感染小鼠脑（生理盐水中 10% 悬液）与兔血清 1:1 稀释 |
| VR-897 | 甲型流感病毒 | 感染尿囊液 + 10% 蔗糖 |
冻干程序要点：商业冻干机中先在 -30℃ 保持 18~48 小时（取决于添加剂），然后以 10℃/小时将搁板温度升至产品温度达 25℃；循环完成后无菌氮气回填并压紧瓶塞，安瓿瓶外部消毒后密封；次级干燥将残余水分降至 1% 或以下。冻干培养物复苏：加入无菌双蒸水复水，充分混匀并用培养基稀释，加入扩增宿主细胞培养物，在推荐温度和大气条件下孵育。
六、特定毒株的保存策略
1）腺病毒：不稳定的病毒悬浮液在培养基中收获后分装安瓿瓶冷冻；
2）疱疹病毒：部分成员（如巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒）在宿主外失去活力，保存前应保持感染细胞完整；
3）鸡胚中培养的病毒：尿囊液或卵黄囊制备物可冷冻或冻干，蛋的高蛋白含量本身起到冷冻保护剂作用，可能无需其他添加剂；
4）体内培养的病毒：以器官悬液收获后冷冻保存，加入无菌 50% 甘油或 10~50% 血清作冷冻保护剂。
特殊危害（引自 ATCC 指南）：动物病毒保存时注意污染、玻璃安瓿瓶破裂、打开安瓿瓶时冻干病毒散播、液氮操作等风险；须遵循无菌技术、在生物安全柜中操作、穿戴防护服。
七、订购与选型
保存方式选错，轻则滴度下降，重则整批毒株报废。杭州沐昀科技有限公司可通过正规渠道协助询价采购 ATCC 标准毒株（含冷冻与冻干两种形式）及冷冻保存相关试剂，电话 15157125312，也可通过页面在线咨询留言，注明所需编号即可。
常见问题
说明与主要参考来源
ATCC《Virology Culture Guide》Preservation 章节，含冷冻制备示例表、冻干制备示例表（atcc.org）。
本文依据 ATCC 官网公开资料整理，仅供科研与技术参考，不构成实验操作规程。文中操作细节与参数请以所购产品的说明书（Product Sheet / COA）及 ATCC 官方 PDF 指南为准。涉及感染性材料的操作须在具备相应生物安全等级的设施中进行。
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