引言
培养液清亮、细胞状态看起来正常，实验数据却越来越难重复，这背后可能藏着细胞培养最常见也最隐蔽的污染：支原体。核心数据先说结论：依据 ATCC 官网资料，连续细胞系的支原体污染率约为 15%~35%，原代细胞也有至少 1% 的污染率；由于支原体不会使培养液变浑浊，污染可以长期存在而不被发现。本文整理支原体的特性、对细胞的影响、三类检测方法对比与预防要点。
一、支原体是什么：为什么这么难缠
支原体属于柔膜体纲（Mollicutes），是一类无细胞壁的细菌，也是已知最小的自由生活细菌之一，直径约 0.2~0.8 µm。个体小加上没有细胞壁，使它能穿过部分过滤系统，并在培养液中长到很高浓度也不产生浑浊。
已发现的支原体超过 190 种，其中人、牛、猪来源的 20 种在细胞培养中被鉴定出来；8 个种贡献了约 95% 的细胞培养支原体污染：
| 物种 | 常见来源 |
|---|---|
| M. arginini（精氨酸支原体） | 牛（常与血清相关） |
| M. fermentans（发酵支原体） | 人 |
| M. hominis（人型支原体） | 人 |
| M. hyorhinis（猪鼻支原体） | 猪 |
| M. orale（口腔支原体） | 人（操作人员） |
| M. pirum（梨支原体） | 人 |
| M. salivarium（唾液支原体） | 人 |
| Acholeplasma laidlawii（莱氏无胆甾原体） | 牛（常与血清相关） |
污染途径包括不良培养操作（如重复使用移液枪头把污染培养基带入无菌培养基）、设备故障（如层流净化功能异常，把含支原体的尘埃和气溶胶散布到安全柜内），以及同时操作洁净与污染培养物造成的交叉污染。污染源可来自感染细胞系、操作人员、试剂、培养基与共用设备。
二、为什么污染长期不被发现
支原体的隐蔽性来自三点：
1）培养液中长到 10⁷~10⁸ 个/mL 也不引起浑浊或 pH 明显变化，肉眼和常规观察无法发现；
2）基因组极小（约 580~2220 kb），代谢通路少，不足以引起培养基的明显变化；
3）无细胞壁，常规用于细菌防控的抗生素对它大多无效。
因此污染可能持续数周甚至数月不被察觉，期间实验数据不一致、不可重复或难以解释。
三、支原体对细胞的影响
依据 ATCC 官网资料，支原体与宿主细胞直接相互作用并争夺营养，可改变细胞的表型与功能特性，包括：
1）染色体畸变；
2）干扰 DNA 与 RNA 合成；
3）细胞膜抗原性改变；
4）抑制细胞增殖与代谢；
5）转染效率下降；
6）基因表达谱改变；
7）影响病毒产量，严重时导致细胞死亡。
对生物制药企业而言，生产用细胞基质的支原体污染还构成患者安全风险与批次报废、产品召回的经济风险，因此在产品开发与生产全程都需要例行支原体检测。
四、常规抗生素为什么防不住支原体
很多实验室靠培养基里常规添加抗生素来「防污染」，这对支原体基本无效：
1）青霉素：对支原体无效，因为支原体没有细胞壁，青霉素的作用靶点不存在；
2）链霉素：仅能抑制约一半的支原体菌株，对其他许多菌株无效；
3）庆大霉素：在细胞培养常规使用浓度下基本无效。
ATCC 提示：支原体对细胞培养中常用的多数抗生素混合物具有耐受性，不要不加区别地依赖抗生素来预防污染，反而可能掩盖污染、诱导耐药。
五、三类检测方法对比
| 方法 | 原理 | 周期 | 特点与局限 |
|---|---|---|---|
| 直接培养法 | 琼脂与肉汤培养基接种培养，观察煎蛋状菌落 | 可达 28 天 | 检测活菌、可确认活动性感染，是传统金标准；但费力费时，并非所有菌株都易培养，需要专业判读 |
| 间接 DNA 染色法（Hoechst 33258） | 荧光染料结合 DNA，胞质内出现丝状染色为阳性 | 数天内 | 快速、成本低；通用 DNA 染色，特异性有限，阳性结果常需其他方法确认 |
| PCR 法 | 针对 16S rRNA 保守区等目标扩增 | 数小时 | 快速、灵敏、可检 60 种以上柔膜体纲物种（含不可培养菌株）；检测的是 DNA，不能区分活菌与死菌 |
方法选择思路（引自 ATCC 建议）：需要确认活菌或在受监管的生产环境，选培养法；日常筛查、快速出结果、广谱检出，选 PCR；高频低成本监测可配合生化法（检测代谢活性，快速简便，谱较窄，阳性需 PCR 或培养确认）；DNA 染色适合作为快速筛查的补充手段。许多实验室组合使用：PCR 做日常监测，培养法做确认与法规场景。
以 ATCC PCR 法（通用支原体检测试剂盒，ATCC 30-1012K）为例：采用针对支原体基因组 16S rRNA 编码区保守段的通用引物与 touchdown PCR 策略，产物为 434~468 bp 的条带，灵敏度低至 20 个基因组拷贝，可覆盖上述 8 种高频污染菌及无胆甾原体、螺原体、脲原体等属。
六、预防要点
支原体污染一旦发生很难清除，预防的价值远大于处理。依据 ATCC 官网建议：
1）规范无菌操作：穿戴个人防护装备，在经认证的垂直层流生物安全柜内操作；
2）新细胞系一律隔离检疫，确认无污染后再并入正常培养区，降低交叉污染风险；
3）培养基、血清和试剂从无支原体的来源采购并留存证明；
4）执行种子库原则（seed stock principle）：保留原始种子批，工作库污染后可随时用种子库重建，快速恢复；
5）定期对细胞进行支原体检测，把检测纳入常规培养流程；
6）不滥用抗生素，不把常规抗生素当作防支原体的手段。
七、发生污染怎么办
依据 ATCC《动物细胞培养指南》：清除培养物中的污染耗时且不一定成功，弃去污染培养物、从无污染库存重新开始是首选。如果细胞独特且不可替代，可先鉴定污染物并做药敏测试，选择合适抗生素处理 1~2 周，再无抗生素培养 1~2 个月，然后用高灵敏方法复测，并保持周期性复测以确认污染不复发。注意抗生素可能对细胞有毒性，治愈后的细胞株可能出现与亲代不同的特性，需评估其是否仍适用于原实验目的。
八、订购与选型
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常见问题
说明与主要参考来源
1. ATCC 官网：Mycoplasma Contamination（atcc.org/the-science/authentication/mycoplasma-contamination），查阅日期 2026-11-10；
2. ATCC：Universal Mycoplasma Detection Kit 应用说明（atcc.org/resources/application-notes/universal-mycoplasma-detection-kit）；
3. ATCC 白皮书：Mycoplasma Quality Control of Cell Substrates and Biopharmaceuticals；
4. ATCC 博客：Why Mycoplasma Detection Is Essential for Reliable Cell Culture Research（2026）；
5. ATCC《Animal Cell Culture Guide》污染检测与处理部分。
本文依据 ATCC 官网公开资料整理，仅供科研与技术参考，不构成实验操作规程。检测方法的选择与执行以所在机构质量管理要求及相应法规标准为准。
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