鸡胚病毒培养操作指南：四种接种途径与关键参数

引言

鸡胚是病毒培养的经典扩增宿主，流感疫苗毒种的传统生产方式至今仍在使用。核心要点：鸡胚培养病毒有尿囊腔、羊膜腔、绒毛尿囊膜（CAM）与卵黄囊四种接种途径，流感病毒常用 10~11 日龄 SPF 鸡胚经尿囊腔接种，在 33~35℃ 孵育 2~3 天后收获尿囊液。本文依据 ATCC《Virology Culture Guide》，整理四种途径的分步操作、关键参数与感染判定方法。

一、为什么用鸡胚培养病毒

依据 ATCC 指南，鸡胚作为扩增宿主的优点：易于照料、病毒复制快、天然无菌环境。使用要求：胚胎存活、血管和气室发育良好，且来自无特定病原体（SPF）鸡群。

接种前必须逐枚照蛋检查：健康胚胎应有气室、发育良好的血管和可见的运动。存活鸡胚的尿囊膜内有小血管（照蛋可见），胚胎眼部看起来像移动的黑点。

二、四种接种途径怎么选

ATCC 指南给出的鸡胚扩增参数示例：

三、尿囊腔接种（多数病毒常用）

依据 ATCC 指南：

1）大多数病毒需要 10 日龄胚胎；照蛋时用铅笔画出气室线，用 18.5 号针头在气室上戳孔；

2）用配 22.5 号针头的 1.0 mL 注射器，将病毒接种物注入尿囊腔，勿刺到胚胎；

3）用胶带或蜡密封小孔；

4）在推荐条件下孵育；接种后 12~18 小时照蛋，弃去非存活胚胎；

5）收获前将鸡胚冷藏至少 2 小时，轻敲气室上方蛋壳使其破裂；

6）用无菌剪刀剪开气室周围蛋壳；

7）用注射器或移液器吸取尿囊液，每枚蛋约 5 mL，视为感染性物质处理。

四、羊膜腔接种

依据 ATCC 指南：

1）照蛋时在鸡蛋侧面打一个小孔，操作缓慢，以免刺到胚胎；

2）用 1.0 mL 注射器插入针头，直至羊膜囊轻微移动，刺穿膜并缓慢注入液体；

3）立即用胶带或蜡密封小孔；

4）推荐条件下孵育，接种后 12~18 小时照蛋，弃去非存活胚胎；

5）收获羊水前，孵育后冷藏至少 2 小时；

6）必须用针头和注射器吸取液体，每枚胚胎约 1.0 mL。

五、绒毛尿囊膜（CAM）接种

依据 ATCC 指南：

1）在胚胎所在侧标记一个无大血管的区域，并在气室上方区域做标记；

2）在侧面和气室上方各打一孔，注意不要损伤 CAM；

3）对气室上方孔轻轻施加吸力（在照蛋器上进行），观察 CAM 下降形成新气室；

4）在下降的膜上加入 1.0 mL 病毒接种物，旋转鸡蛋使其均匀分布；

5）用指甲油密封孔；

6）每天照蛋检查，24 小时内死亡的胚胎应弃去；

7）收获前冷藏至少 2 小时；制作胶带手柄（胶带中间对折粘连、两端粘在蛋壳上）；

8）切掉蛋壳上半部（含感染区域），轻轻取出附着在壳上的 CAM；

9）将 CAM 放入含 PBS 的培养皿中平铺，置于暗色表面上便于计数痘斑。

六、流感病毒的鸡胚培养与感染判定

流感病毒（甲型、乙型）的推荐宿主为 SPF 10~11 日龄鸡胚或 MDCK 细胞（ATCC CCL-34）。鸡胚途径：接种尿囊腔后 2~3 天、约 34℃ 孵育；组织培养途径为 33~35℃，CPE 扩散至整个单层时收获。感染效应表现为鸡红细胞凝集，组织培养中细胞变圆和脱落。

感染与滴度判定采用血凝反应（HA）：系列稀释病毒接种鸡胚，孵育收获尿囊液后，将尿囊液与 0.5% 鸡红细胞悬液（PBS 配制）按 1:1 加入 96 孔圆底板，轻拍混匀，室温静置 30~45 分钟读数：阴性孔红细胞呈「纽扣状」沉于孔底，阳性孔呈「晶格状」凝集；终点为产生阳性结果的最高稀释度，例如 HA = 1:640 表示血凝终点为 1:640。订购鸡胚按适当日龄（8~12 天）进货，孵化器旁放水盘保湿；接种后 24 小时照蛋检查病毒诱导的死亡，死胚放入生物危害袋；存活胚胎先置于 4℃ 至少 2 小时处理。

七、订购与选型

鸡胚途径的关键参数（日龄、途径、孵育温度与天数）因毒株而异，务必以毒株产品说明书的推荐为准。杭州沐昀科技有限公司可通过正规渠道协助询价采购流感病毒等 ATCC 标准毒株，电话 15157125312，也可通过页面在线咨询留言，注明所需编号即可。

常见问题

说明与主要参考来源

ATCC《Virology Culture Guide》Viral Replication and Propagation（鸡胚扩增部分）、Viral Titering（CEID 部分）章节，含鸡胚扩增参数表（atcc.org）。

本文依据 ATCC 官网公开资料整理，仅供科研与技术参考，不构成实验操作规程。涉及感染性材料与动物使用的操作，须遵守所在机构的生物安全与实验动物管理规定。